实验教学大纲

实验课部分

实验一　蛋白质的两性反应及等电点的测定

　1、本次实验的目的和要求
　　 了解蛋白质的两性解离性质，学习测定蛋白质等电点的一种方法。
　 2、实验内容或原理
　　 蛋白质是由氨基酸构成的，同时具有碱性的氨基和酸性的羧基，还有一些支链基团也带电荷，构成了蛋白质，即可以和酸发生反应，又可以和碱发生反应的两性性质。在某一pH值下，蛋白质即不向正极移动也不向负极移动，此时该溶液的溶解度最低，此时该溶液的pH值，称为该溶液的等电点。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 试管、离心管、研钵、移液管、酪蛋白、HCl 、NaOH
　 4、实验步骤
　　 蛋白质的两性反应、蛋白质等电点的测定
　 5、教学方式
　　 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。
　 6、考核要求
　　 以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告等平时成绩为主要考核内容。
　 7、实验报告要求
　　 实验报告应包括下列各项：
（1）报告的题目（要简明确切）；
（2）写报告人及共同测定人员的姓名；
（3）实验目的；
（4）实验原理；
（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；
（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；
（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用文字说明
（8）分析与讨论，要对实验结果作出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；
（9）回答思考题。

实验二　考玛斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

　1、本次实验的目的和要求
　　 学习和掌握考玛斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
　 2、实验内容或原理
　　 考玛斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕褐色，当它与(浓度0~100μg /ml)蛋白质结合呈蓝色，颜色随蛋白质浓度的增加而加深，在595nm波长下光吸收和蛋白质浓度成正比。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计　牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250
　 4、实验步骤
　　 标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算
　

实验三　血清球蛋白的分离——分子筛凝胶层析法

　1、本次实验的目的和要求
　　 学习和掌握分子凝胶层析法的原理和技术（溶胀，装柱，加样和洗脱），了解葡聚糖凝胶的选用原则　
　 2、实验内容或原理
　　 分子筛指的是一些多孔介质。当含有不同大小分子的混合物流经这一介质时，小分子的物质能进入介质的孔隙，而大分子的物质则被排阻在介质之外，从而达到分离的目的，这种作用称为"分子筛效应”。当用含有硫酸铵和球蛋白的混合物进行上样时，球蛋白最先被吸脱下来，硫酸铵后被吸脱下来，从而达到分离的目的。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 层析柱、试管、铁架台、恒压瓶、饱和硫酸铵、10%氢氧化钠、1%硫酸铜、1%氯化钡
　 4、实验步骤
　　 凝胶的预处理、装柱、盐析、上样收集、鉴定、数据处理；

实验四　醋酸纤维薄膜电泳法分离动物血清蛋白质

　1、本次实验的目的和要求
　　 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理，操作及测定动物蛋白质的相对百分含量技术
　 2、实验内容或原理
　　 蛋白质是两性电解质，在pH值大于其等电点的溶液中成为带负电的阴离子，在电场中移向阳极。血清中的数种蛋白质在同一pH条件下由于其解离状况不同、，带点不同，在电场中移动速度不同，采用电泳法可将其分离。醋酸纤维素是纤维素羟基乙酰化形成的纤维素乙酰酯将它溶于有机溶剂后，涂抹成均匀的薄膜待溶剂干后即称为醋酸纤维薄膜。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 水平电泳装置、培养皿、试管、电泳仪、电泳槽、0.07mol/L 巴比妥-巴比妥钠缓冲液、氨基黑10B、漂洗液、透明液
　 4、实验步骤
（1）醋酸纤维薄膜的润湿和选择
（2）制作电桥：将缓冲液倒入电泳槽中，根据电泳槽的纵向尺寸，于两极支架上各放入三层滤纸，滤纸的一端与支架的前端对齐，另一点进入缓冲液中，除去气泡使滤纸紧贴于支架上，即为纸滤桥。
（3）点样：无光泽面朝上，在距负端1.5cm处，盖玻片点样注意点样时应使血清均匀的分布在点样区形成有一定宽度粗细均匀的直线，这是获得重要清晰区带电泳图谱的重要环节之一。可事先在滤纸上练习点样。
（4）电泳：将点好样的薄膜无光泽面向下，两端贴在电泳槽支架的滤纸上，点样端在负极。平衡10min ，调电压最大，然后调电流，0.6mA/条，预电泳10min，调电流1mA/条，电泳45min关闭电源.注意电泳过程中防止电压偏高或偏低.
（5）电泳完毕，取出薄膜直接浸入染色液(.氨基黑10B)中，染色五分钟
（6）漂洗：漂洗液漂洗直至背景染色脱去呈白色，可看出清晰的五条区带.
（7）记录：由正极依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。记下迁移距离。
（8）透明：甲液2min，乙液1min，宁缺毋滥。取出薄膜贴于载玻片上放置于阴凉处晾干备用
　

实验五　血清乳酸脱氢酶同工酶的分离与测定（聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法）

　1、本次实验的目的和要求
　　 掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。学会用盘状胺凝胶电泳分离同工酶。
　 2、实验内容或原理
　　 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺，在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。血清样品中含有5种同工酶，在同一pH条件下，解离状况不同，通过聚丙烯酰胺凝胶具有的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应将五种同工酶分离。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 离心机、中压电泳仪，电泳槽、注射器、玻璃管、加样器、丙烯酰胺贮液、过硫酸铵、蔗糖、核黄素、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT
　 4、实验步骤
（1）贮液及制备（分离胶每份15ml，浓缩胶每份5ml，可供60人使用）
（2）制胶：用注射器在玻璃管管底加入3-4滴蔗糖→加样器加胶至管高2/3处→加1cm重蒸水水封→放到水浴锅的试管架上聚合→除去上层水封→加入1cm大孔胶→加1cm重蒸水水封置于灯管下→ 聚合至凝胶呈乳白色。
（3）安装：将卸掉皮筋、胶帽、乳胶管的玻璃管装入圆盘电泳槽中，排出管两端的气泡。
（4）上样：样品组成为：兔血清 + 40%蔗糖 + 0.1%溴酚蓝（体积比1：1：1）。上样80μl。
（5）电泳：上槽连接负极，下槽连接正极。开始时调节电流2mA/管，3min后调节电流4mA/管。电泳时间根据指示剂染料的迁移来决定，当溴酚蓝指示剂接近凝胶底部1cm时停止电泳。
（6）剥胶：用注射器吸满水，从浓缩胶的一端小心的插入到管壁与凝胶之间，转动玻璃管同时推动注射器，靠水流的压力和润滑作用将玻璃管与凝胶分开，最终使凝胶从玻璃管中脱落。
（7）．染色：避光37℃保温10-30min，凝胶条上可显示出紫色的LDH带。从正极依次为LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4）（其中LDH4和LDH5含量较少）
（8）．计算相对迁移率：
相对迁移率=点样点到各带的距离/点样点到染料的距离
（9）．染色的固定：将凝胶条放入7%醋酸中脱色和固定。

实验六　动物肝脏DNA的提取

　1、本次实验的目的和要求
　　 了解DNA和RNA 的不同溶解性质。学习用盐溶液法从动物组织中提取DNA的原理和操作技术
　 2、实验内容或原理
　　 核酸和蛋白质时构成生物有机体的主要成分，在生物体内核酸通常是与蛋白质结合成核带白的形式存在，核蛋白有脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白。在浓的Nacl溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度更大，核糖核蛋白溶解度很小，而在稀的Nacl溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度很小，而核糖核蛋白溶解度很大，因此可利用不同浓度的Nacl溶液将核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白从样品中分别提取出来.经提取到的核蛋白用SDS处理，会引起蛋白变性而与DNA分开，氯仿―异戊醇可将蛋白沉淀除去，DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量的冷乙醇，DNA即析出。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 试剂：0.1MNACL-0.05M柠檬酸钠混合液，5M NaCl，25% SDS，氯仿异戊醇， 95%冷乙醇。
　　 仪器：小烧杯、玻璃棒、大滴管、量筒、离心杯套筒、匀浆器、小天平、称量纸。
　 4、实验步骤
(1)细胞的破碎：取8g新鲜的动物内脏，用15ml 0.1M Nacl -0.05M柠檬酸钠混合液放入匀浆器中研磨，然后倒出匀浆，4000rpm 离心10min，弃去上清液。
(2)洗涤：向沉淀中加入10ml0.1M Nacl -0.05M柠檬酸钠混合液，玻璃棒搅拌，4000rpm离心，10min，倒掉上清液。(3)蛋白质变性：向沉淀中加入10ml0.1M Nacl -0.05M柠檬酸钠混合液，混匀后加入8滴SDS60℃水浴保温10min ，此步的目的是使DNA与蛋白质分离。
(4)DNA溶解：稍冷加入5MNacl溶液2ml，搅拌10min。
(5)蛋白质沉淀：加等体积的氯仿―异戊醇，震荡20min，4000rpm离心10min，离心杯中出现三层，上层为含DNA和残留的DNA核蛋白的水层，中层为变性蛋白质凝胶，下层是氯仿―异戊醇的有机相层。
(6)DNA析出：吸出上层的水相，慢慢加入95%冷乙醇，用玻璃棒搅出丝状的DNA，晾干即为DNA实验产品。

实验七　紫外吸收法测定核酸含量

　1、本次实验的目的和要求
　　 学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法
　 2、实验内容或原理
　　 DNA和RNA都具有紫外吸收的性质，它们的紫外吸收高峰在260nm处。其紫外吸收特性是由于它们含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统的特性所决定的。每毫升溶液含1μgDNA钠盐的光吸收值为0.020，因此在260nm处测的未知样的光吸收值即可求出其含量。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 试管、紫外分光光度计、水浴锅　晾干的DNA粗制品，蒸馏水
　 4、实验步骤
（1）用盖玻片刮取1mg DNA粗制品，溶于10倍体积的蒸馏水中。
(2)在260nm波长下，以蒸馏水作参照，在紫外分光光度计上测定其吸收值。

实验八　应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用

对照管加入肌肉靡后立即煮沸10min，而后放入37℃水浴中保温30min，测定管37℃保温30min后，立即于沸水浴中加热10min终止反应。冷却后将二管分别过滤2滴到载玻片上待用。
（3）．点样：取层析纸一张，找出圆心。通过圆心作垂直线，在2条垂直线上于圆心相距0.5cm处，分别作为测定管和对照管及标准丙氨酸，谷氨酸的点样位置如图所示。点样时将毛细管口轻轻点在滤纸上，使斑点直径3mm，重复三次，每次待完全干燥后再点下一次。
（4）展层：点样前在层析纸的圆心处打一小洞，取一小层析纸条，剪成刷状，卷成灯芯状，插入小孔内，使毛刷朝下，点样面朝上平放在盛有饱和苯酚的培养皿中，上面盖上合适的培养皿。大约45min待溶剂前沿达到培养皿边缘小于1cm处，取出层析纸，记下溶剂前沿去掉纸芯用吹风机吹干层析纸。
（5）显色：用喷雾器向层析纸均匀喷洒0.1%印三酮溶液，吹风机吹干，层析纸上可看到紫色的斑点，比较色斑的位置及色的深浅记录点样点到色斑的距离及到点样点到溶剂前沿的距离。
（6）计算每个样点的Rf值
Rf= 点样点到色斑的距离 / 点样点到溶剂前沿的距离

实验九　维生素C含量的测定

　1、本次实验的目的和要求
　　 学习定量测定维生素C的原理和方法，掌握微量滴定技术。
　 2、实验内容或原理
　　 维生素C是烯醇式己糖酸内酯。其分子中C2、C3位上的两个相邻的烯醇式羟基极易分离释放出H+，故维生素C虽无游离的羟基却是相当强的有机酸，又因维生素C能防治坏血病，所以VC又称为抗坏血酸。
　　 VC具有广泛的生理功能。在体内参与氧化还原反应，作为递氢体，维持酶分子中的巯基及谷胱甘肽处于还原状态，使其不受氧化而失去生物活性。此外，VC还可促进叶酸还原为四氢叶酸及高铁血红蛋白还原为血红蛋白等。VC参与体内胆固醇、儿茶酚胺、脯氨酸等的羟化反应。能促进胶原蛋白和粘多糖的合成，降低血管壁的通透性及脆性。缺乏VC，胶原结构异常，细胞间隙增大，牙龈及黏膜易出血等造成坏血病。
　　 2，6-二氯酚靛酚碱性呈蓝色，在酸性环境下呈淡红色，被还原后变为无色。
　 3、需用的仪器和试剂
　　 微量滴定管、研钵、容量瓶、50ml三角瓶、2，6-二氯酚靛酚，标准维生素C溶液
　 4、实验步骤
（1）称取6g橘子，加10ml2%草酸研磨，转移并定容至50ml容量瓶中. 静置10min过滤。
（2）准确吸取滤液10ml置于100ml锥形瓶中，用微量滴定管以0.02%2，6-二氯酚靛酚滴定到淡红色并保持15s不变色。记录所用染料的体积v。
（3）取标准Vc1ml置100ml锥形瓶中，加2%草酸9ml ，用微量滴定管以0.02%2，6-二氯酚靛酚滴定到淡红色并保持15s不变色。由所用染料的体积v′计算出1ml染料相当于维生素C的mg数（ T=0.1/ v′。）
(4)计算；维生素C含量（mg/100g）=V ×T×5×100 / W（6g）